Привезенная на рыбоводный завод икра подвергается обязательному обследованию на степень ее оплодотворения, а также оценивается стадия или этап ее эмбрионального развития. В чашку Петри из каждой привезенной на завод партии аккуратно вместе с водой помещают не менее 100 икринок. Затем заполненную чашку Петри немедленно ставят на ровную поверхность, покрытую черной тканью. Использование такой ткани позволяет лучше осмотреть икринки на наличие в них зародышевого бугорка (диска). Он принимает форму, близкую к полушарию. Его контур четко очерчивается. По А. И. Смирнову (1975), диаметр сформировавшегося зародышевого диска у осенней кеты варьирует в пределах 0,9–1,0 мм. При наличии в пробе побелевших икринок, т. е. с коагулированным белком, а также икринок, где зародышевый диск не просматривается, их выбраковывают. Например, в пробе из отобранных 100 икринок были обнаружены 3 икринки с характерными для неоплодотворенной икры признаками. Значит, в обследуемой партии 97% икринок были оплодотворены и 3% не оплодотворены или погибли в процессе транспортировки на завод.
Но наиболее точным способом оценки количества неоплодотворенных и погибших икринок в период транспортировки является их визуальный осмотр в осветляющем растворе.
В 1 л воды необходимо растворить 7 г поваренной соли мелкого помола и 50 мл 70%-й уксусной эссенции. В этот раствор по вышеописанному примеру помещают 100 икринок. Через 10–15 мин присутствующие в пробе побелевшие икринки станут прозрачными, как живые, но в этом случае необходимо просмотреть их на наличие зародышевого диска.
Такой же раствор следует использовать при обследовании икринок в течение всего периода инкубации.
Для достижения более точной и объективной оценки количества оплодотворенных икринок, стадий развития зародышей как при приемке икры на завод, так и в течение ее инкубации необходимо дополнительно использовать метод ее при- жизненного обследования с помощью оптических приборов, например бинокуляра МБС-10 или новейшего из оптических приборов ZEISS-STEMI DV 4 (8×32) (рис. 32).
Рис. 32. Оптические приборы
Зародышей рассматривают прижизненно, не вскрывая оболочку икринки. Перед этим икру мягко перекатывают между пальцами, пока ее оболочка не станет прозрачной и зародыш не будет видимым под микроскопом (бинокуляром). Предварительного фиксирования икры в каком-либо фиксирующем растворе не требуется. Определение этапа и стадии развития зародышей должно осуществляться не менее чем на 10 икринках. Икринки рассматривают при разных уровнях освещения – при падающем (проходящем) или смешанном освещении.
В ранний инкубационный период (до 20–25 сут) в целях контроля за развитием зародышей, а также в случае закладки на завод отдельных партий икры по каким-либо причинам в непредусмотренные сроки (например, при задержке сроков поступления на завод более чем на 8 ч от начала ее оплодотворения), кроме прижизненного обследования, используют способ определения этапов и стадий раз- вития зародышей у эмбрионов, зафиксированных в 4%-м растворе формалина. Этот способ позволяет выявить этап и стадию развития зародышей при содержании икры на заводе на конкретный момент или этап и стадию развития зародышей при закладке икры в инкубаторы. Однако осматривать зародышей (из числа не менее 10 икринок) следует только после окончательной фиксации (затвердения) икринок, обычно на следующие сутки после фиксации. Перед началом этих работ икринки в целях безопасности здоровья (из-за токсичности формалина) необходимо промыть в течение 30–40 мин в проточной воде и только после этого приступать к обследованию зародышей.
Под объективом бинокуляра сначала на малом увеличении при помощи двух препаровальных игл аккуратно, стараясь не повредить зародыш, полностью снимают оболочку. Скальпелем отрезают участок икринки с зародышем или сам зародыш и приступают к осмотру.
На рис. 33 и 34 показаны ранние и поздние стадии эмбрионального развития тихоокеанских лососей на примере осенней кеты, что позволит более точно определить стадию их эмбрионального развития. Подробное описание постадийного и поэтапного эмбрионального развития отдельных видов тихоокеанских лососей (кеты, горбуши, кижуча и нерки) дано в монографии А. И. Смирнова (1975).
Приведем пример описания отдельных этапов и стадий развития зародышей лососей на определенные даты обследования.
Для выполнения этой работы использовалась икра нерки, полученная 26 августа 2010 г. «сухим» способом оплодотворения и заложенная на инкубацию в проточную емкость, установленную на участке литорали оз. Киси. Развитие зародышей проходило при температуре воды от 13 до 16,4°С и содержании в ней кислорода 7,4–9,2 мг/л. Через 24 и 47 ч с момента оплодотворения икры 27 и 28 августа соответственно были отобраны и зафиксированы в 4%-м растворе фор- малина ее пробы – по 10 икринок. В дальнейшем в камеральных условиях из изготовленных препаратов были сделаны фотоснимки.
По итогам биометрических измерений установлено, что размер (диаметр) и масса оплодотворенных икринок нерки в среднем составляют 5,48 мм и 102 мг соответственно (табл. 1). Пределы варьирования размеров икринок относительно невысокие – 5–6 мм, а диапазон варьирования их массы более широк – от 92,2 до 104,3 мг.
Таблица 1. Биометрические показатели оплодотворенной икры нерки, происхождение оз. Киси, 2010 г.
|
Размер (диаметр), мм |
Масса, мг |
| 5,48±0,11 | 102,0±1,3 |
| 5,0–6,0 | 92,2–104,3 |
По истечении первых суток наблюдений за развитием зародышей нерки их возраст составил 24 ч / 14,7 градусо-дней. Зародыши находились на 2-м этапе эмбрионального развития (на этапе дробления зародышевого диска). На рис. 35 показана крупноклеточная морула. Контуры морулы четкие, в плане она имеет полусферическую форму диаметром 1,0–1,1 мм. Нижележащие бластомеры расположены не так плотно, как в поверхностном слое. К исходу первых суток в моруле насчитывалось 60–84 бластомера.
Рис. 33. Ранние стадии развития осенней кеты:
А – икринка после набухания, вид сверху; заметно темное микропилярное поле; левее через оболочку просвечивается зародышевый диск; Б – живая икринка сбоку на стадии двух бластомеров в проходящем свете; В – зародышевый диск на стадии бластомерной бластулы; Г – икринка на стадии появления «краевого узелка»; Д – стадия «краевого узел- ка» (дифференцировка зародышевых пластов и хорды), вид сверху в проходящем свете; Е – участок зародышевого диска на стадии образования переднего конца зародыша;
Ж–М – стадии дробления зародышевого диска, вид сверху. Рисунки А–Е по Н. Н. Дислеру (1957), рисунки Ж–М по А. И. Смирнову (1975).
В конце вторых суток при возрасте зародышей 47 ч / 28,9 градусо-дней наблюдали следующий, 3-й этап эмбрионального развития (этап бластулы) (рис. 36). Клетки бластулы не просматривались. Бластула приняла плоскую дискообразную форму (бластодиск) размером 1,5–1,7 мм и располагалась в зоне мелких жировых капель икринок.
Рис. 34. Стадии начала сегментации мезодермы и формирования головы и туловища зародыша осенней кеты:
А – зародыш на стадии 3 сегментов, снятый с фиксированной икринки, вид сверху;
Б – стадия 7 сегментов; В – стадия 13 сегментов; Г – зародыш на стадии 30–31 сегмента, вид сбоку (как и на следующих рисунках); Д – стадия 46–47 сегментов; Е – стадия 58 сегментов (по Н. Н. Дислеру, 1957)
Рис. 35. Зародыши нерки на 2-м этапе эмбриогенеза (этапе дробления зародышевого диска), стадия – крупноклеточная морула, 60–84 бластомера, 24 ч от оплодотворения, температура воды 13–16,4ºС:
а – фрагмент икринки с зародышевым бугорком и оболочка икринки, увеличение 20×2; б – вид сбоку, четко просматриваемый зародышевый бугорок, увеличение 20×2; в – вид сверху, увеличение 20×3; г – вид сверху, подсушенный фрагмент икринки, увеличение 20×3; д – вид сверху, подсушенный фрагмент икринки, увеличение 20×4
Рис. 36. Зародыши нерки на 3-м этапе развития – бластула:
а – общий вид икры с просматриваемым бластодиском, увеличение 20×1;
б – расположение бластодиска на участке мелких жировых капель, увеличение 20×4
В лаборатории рыбоводного завода в целях практического обучения молодых специалистов следует создать банк препаратов (фрагментов икринок, зародышей, содержащихся во флаконах из-под пенициллина, заполненных 4%-м раствором формалина) с указанием на каждой маркировке вида рыбы, этапа и стадии развития зародыша, температуры воды, возраста зародышей, выраженного в градусо- днях или градусо-часах).
